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免疫印跡Western Blot實(shí)驗(yàn)代測

免疫印跡(immunoblotting)又稱蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)，它是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術(shù)。由于免疫印跡具有SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性，現(xiàn)已成為蛋白分析的一種常規(guī)技術(shù)。免疫印跡常用于鑒定某種蛋白，并能對(duì)蛋白進(jìn)行定性和半定量分析。
凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一種研究DNA 結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA 結(jié)合序列相互作用的技術(shù)，可用于定性和定量分析。這一技術(shù)zui初用于研究DNA 結(jié)合蛋白，目前已用于研究RNA 結(jié)合蛋白和特定的RNA 序列的相互作用。

上海信帆代做實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目:ELISA,免疫組化,免疫印跡Western Blot,放射免疫,實(shí)時(shí)熒光定量ＰＣＲ,，免疫組織，特殊染色,病理學(xué)檢測技術(shù)服務(wù)等等!我們擁有的實(shí)驗(yàn)室,客戶檢測項(xiàng)目均提供實(shí)驗(yàn)室儀器型號(hào),提供操作詳細(xì)步驟.歡迎!
Western Blot實(shí)驗(yàn)
成功完成Western Blot檢測，必須滿足4個(gè)條件：

凝膠洗脫：轉(zhuǎn)移期間蛋白質(zhì)必須從凝膠中洗脫出來，如果蛋白質(zhì)還截留在凝膠中，將無法在膜上進(jìn)行分析

吸附到膜上：在轉(zhuǎn)移過程中蛋白質(zhì)必須吸附到膜上，如果蛋白不吸附，將無法在膜上進(jìn)行分析

處理期間仍截留在膜上：在轉(zhuǎn)移后的處理過程中蛋白質(zhì)必須保持吸附在印跡膜上

處理過程中可接近：被吸附的蛋白質(zhì)必須能夠與檢測試劑接觸，如果蛋白質(zhì)被掩蓋則無法檢測

成功進(jìn)行WB檢測，則設(shè)置合適正確的對(duì)照是*的，只要正確設(shè)置了這些對(duì)照，即可快速和準(zhǔn)確的找到WB的問題所在，并保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和特異性！一般需要設(shè)置的對(duì)照如下：

陽性對(duì)照：明確表達(dá)檢測蛋白的組織或細(xì)胞，用于檢測抗體的工作效率

陰性對(duì)照：明確不表達(dá)檢測蛋白組織或細(xì)胞，用于檢測抗體的特異性

二抗對(duì)照：不加一抗，用于檢測二抗的特異性

內(nèi)參對(duì)照：檢測標(biāo)本的質(zhì)量和二抗系統(tǒng)

空白對(duì)照：不加一抗和二抗；用于檢測膜的性質(zhì)和封閉的效果

WB 檢測基本過程

1 、獲取細(xì)胞或組織裂解物

1)根據(jù)檢測蛋白的位置選擇合適的裂解buffer：

亦可購買商業(yè)化的蛋白提取試劑盒來保證標(biāo)本制備的質(zhì)量

2)選擇合適的蛋白酶抑制劑，避免蛋白降解，從而保證檢測的準(zhǔn)確性！

2 、蛋白定量

常用的蛋白定量方法：Bradford assay, Lowry assay 或BCA assay。定量后，可根據(jù)情況將標(biāo)本保存在-20°C /-80°C備用，進(jìn)行免疫沉淀（IP）或者直接進(jìn)行電泳分離蛋白

3 、電泳分離蛋白質(zhì)

根據(jù)待測蛋白狀態(tài)確定電泳條件：

根據(jù)待測蛋白分子量大小確定凝膠濃度

4 、轉(zhuǎn)膜

根據(jù)不同的檢測目的和待測蛋白的特性,選擇合適的膜類型。常用的轉(zhuǎn)移膜類型有:PVDF膜、硝酸纖維素膜（NC膜）和尼龍膜，其中PVDF和NC膜的使用頻率zui高。各種膜的技術(shù)參數(shù)及比較如下：

5 、封閉

去掉膜上多余的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，降低背景。常用的封閉溶液有：含BSA或者脫脂奶粉的TBST或TBS

6 、一抗孵育

一抗的選擇成功與否，是整個(gè)WB實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵：選擇一抗有以下幾個(gè)注意點(diǎn)：

選擇適合檢測標(biāo)本種屬的一抗（說明書有驗(yàn)證）

選擇適用于WB實(shí)驗(yàn)方法的一抗（說明書有驗(yàn)證）

選擇單克隆抗體或者經(jīng)過親和純化的多克隆抗體

免疫印跡Western Blot實(shí)驗(yàn)代測

一抗的保存和使用：

根據(jù)說明書的要求條件進(jìn)行抗體的保存；一般需要將抗體分裝后放入-20度保存，避免反復(fù)凍融。

抗體的工作液現(xiàn)配現(xiàn)用，在4度保存不要超過2周

根據(jù)說明書濃度使用TBST稀釋一抗。由于實(shí)驗(yàn)室條件和檢測方法等的差異，說明書的稀釋比例只作參考，需要在說明書的濃度周邊進(jìn)行多個(gè)濃度梯度的實(shí)驗(yàn)檢測，然后選擇信噪比的抗體濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。如果說明書沒有濃度，可進(jìn)行多個(gè)稀釋比例進(jìn)行摸索稀釋度（1:100-1:3000）。

孵育條件：4°C孵育過夜（一般大于18個(gè)小時(shí)），根據(jù)抗體親和力不同孵育時(shí)間有所區(qū)別

內(nèi)參的選擇和使用：WB 過程監(jiān)測以及目的蛋白定量的標(biāo)準(zhǔn)！

WB常用內(nèi)參及其技術(shù)參數(shù)：

詳情請(qǐng)參考

7 、二抗孵育

根據(jù)說明書濃度使用TBST稀釋一抗。如果說明書沒有濃度，可進(jìn)行多個(gè)稀釋比例進(jìn)行摸索稀釋度（1:1000-1:20000）。孵育條件一般為室溫1-2小時(shí)

8 、底物孵育

選擇顯色或者化學(xué)發(fā)光底物。一般傾向于化學(xué)發(fā)光，靈敏度高且背景低，節(jié)省抗體用量

9 、結(jié)果分析和檢測

凝膠成像系統(tǒng)檢測或者暗室曝光到膠片

注意事項(xiàng)
1、 抗體：事先咨詢信帆生物，明確抗體種屬及指標(biāo)名稱，確定我司抗體庫否有該抗體可使用，如有一抗可免費(fèi)提供，如無可由雙方協(xié)商而定，客戶自己購買提供或我公司代購；
2、 標(biāo)本收集與保存：
組織樣品  新鮮組織放入液氮或-70度保存，組織不少于100mg（約綠豆大?。?；
培養(yǎng)細(xì)胞  通過細(xì)胞計(jì)數(shù)取不少于100萬個(gè)細(xì)胞于EP管，加入0.5ml生理鹽水或蛋白保護(hù)劑，混勻后保存于冰箱（-70℃，避免反復(fù)凍融）；
血液細(xì)胞標(biāo)本  以抗凝管保存血樣或以淋巴細(xì)胞分離液分離細(xì)胞后加入0.5ml生理鹽水或蛋白保護(hù)劑，保存（-70℃可保存，避免反復(fù)凍融）
血清或細(xì)胞培養(yǎng)液標(biāo)本  離心去掉雜質(zhì)后取上清入EP管，保存（以上4℃可保存15-20天，-70℃可保存，避免反復(fù)凍融）
3 、 樣本運(yùn)輸：可選以下任何的一種方式寄送標(biāo)本
組織樣本、細(xì)胞樣本以干冰運(yùn)輸或加入蛋白保護(hù)劑后加冰袋運(yùn)輸；
細(xì)胞樣本也可以直接快件寄送培養(yǎng)瓶（密封保證不污染，培養(yǎng)液不漏出，細(xì)胞不要長得太滿，50%左右，灌滿培養(yǎng)液）；
血清或上清液直接加冰袋寄送（密封保證液體不漏出，視路途遠(yuǎn)近2-3天可到達(dá)）。

流程：
1、客戶告知實(shí)驗(yàn)分組、編號(hào)、檢測樣本類型、種屬、指標(biāo)，有具體要求請(qǐng)事先說明；
2、簽訂合同，寄送樣本和抗體，如需我方提供抗體請(qǐng)事先說明；
3、客戶支付預(yù)付款，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
4、提供原始數(shù)據(jù)，分析數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)室儀器型號(hào)，所用試劑品牌貨號(hào)，圖片，實(shí)驗(yàn)報(bào)告等！