基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP2/9）明膠酶譜法試劑盒

適用: 檢測(cè) MMP-2、MMP-9 酶譜及活性（Detect MMP2 and MMP9 as low as 1 nM）。 組成與儲(chǔ)存 (50 assays)：

1. 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml ?l, ?20 ?C；
2. 10 × Substrate G, 50 ml, ?20 ?C；

3. 10 × Buffer A, 50 ml, 4 ?C, 使用時(shí)用蒸餾水稀釋；

4. 10 × Buffer B, 50 ml, 4 ?C, 使用時(shí)用蒸餾水稀釋；

5. SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液(#P1501), 4 ?C。

檢測(cè)步驟：

1. 制備含 MMP 底物蛋白的 SDS-PAGE 凝膠：分離膠濃度為 8%。按照標(biāo)準(zhǔn)程序制備 SDS- PAGE 凝膠。將 10 × substrate G 融化，并 90 ?C 加熱 5 分鐘。分別在濃縮膠和分離膠中額外加 入 10 × substrate G 并使之稀釋 10 倍，混勻后加入過(guò)硫酸銨和 TEMED，等待凝膠聚合。

2. 待測(cè)樣品 1:1 稀釋于 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制：4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混合后直接上樣。切勿加熱變性，并且僅 使用不加還原劑的上樣緩沖液。可通過(guò)預(yù)試驗(yàn)確定加樣量，使用普通蛋白預(yù)染  Marker   即可。陽(yáng) 性對(duì)照(可選步驟)：可取人、小鼠、大鼠或兔 100?l 全血與 100?l 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 等體積混合，取 5-15?l 上樣。

3. 低電流恒流電泳，每一塊小膠電流為 20    mA/gel。溴酚藍(lán)跑出凝膠前沿時(shí)結(jié)束電泳。

4. 洗滌凝膠：取出凝膠，去除濃縮膠，放入容器內(nèi)?？上扔眠m量蒸餾水沖洗凝膠，然后加入  10    ml1× Buffer A(用蒸餾水稀釋)，室溫漂洗凝膠 2 × 30 分鐘。中間換液。

5.  孵育：倒掉 Buffer A。加入 10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋)，室溫或 37?C 孵育 1~5 小時(shí)。陽(yáng)性 對(duì) 照或者血中的 MMP 通常 37?C 孵育 1 小時(shí)即可顯示。如 MMP 活性低，應(yīng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間為 10 小時(shí)或 過(guò)一夜。

6.  顯色：倒掉 Buffer B，加入 SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液（操作步驟見(jiàn) SDS-PAGE 凝 膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液說(shuō)明書(shū)）。凝膠的大部分區(qū)域被深染，在有 MMP 條帶的位置 不被染 色而形成透亮區(qū)域。透明區(qū)域的位置和范圍指示 MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及 活性。陽(yáng) 性對(duì)照將在 66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa 位置出現(xiàn)透 明條帶。

7. 條帶掃描：將凝膠放在掃描儀上掃描。雖然 MMP 條帶透明，但凝膠背景并非真正全黑。解決 辦法：可用非透射光掃描，或用軟件圖像處理程序調(diào)整背景顯示為灰度顯示，并盡量設(shè)置為黑 色。MMP      條帶則為白色，這種背景黑條帶白的格式是英文論文中zui常見(jiàn)的格式。

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP2/9）明膠酶譜法試劑盒

說(shuō)明

1. 10 mM 能夠 EDTA *抑制 MMP 活性。

2. 凝膠干燥：可使用聚丙烯酰胺凝膠干膠裝置(#P2000)室溫快速干燥凝膠，作為*記錄保留。

參考文獻(xiàn)：

1. Nagase H and Woessner JF. Matrix Metalloproteinases. J Biol Chem, 1999, 274, 21491-21494
2. Heussen C, and Dowdle EB.Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Anal. Biochem，1980, 102, 196–202

常規(guī)考馬斯亮藍(lán) SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)染色是實(shí)驗(yàn)室常用的凝膠染色方法。銀染方法雖然靈敏度 高，但所需試劑復(fù)雜并且有毒有害，操作步驟繁瑣，難以控制獲得好的染色效果。

染色步驟：

1. 此染色液即為工作液，使用時(shí)直接將聚丙烯酰胺凝膠放在培養(yǎng)皿中以考馬斯亮藍(lán)染色液覆蓋凝 膠，并緩慢搖動(dòng) 2h；

2. 傾去染色液，用脫色液沖洗凝膠；

3. 以脫色液覆蓋凝膠，緩慢搖動(dòng) 2h，傾去脫色液，再加入新脫色液進(jìn)行脫色，直至獲得清晰的 藍(lán)色的條帶和干凈的背景（通常此過(guò)程需要 2～4h，也可脫色過(guò)一夜至清晰的藍(lán)色的條帶和干凈 的背景）；

4. 對(duì)凝膠進(jìn)行分析和照相，凝膠可放置在    7％的乙酸中保存。也可用凝膠干膠裝置（P2000）對(duì) 凝膠進(jìn)行處理后保存。

安全性：含有甲醇，無(wú)特殊毒性，按一般化學(xué)品操作規(guī)程處理。

說(shuō)明：

1. 染色液配方：0.25g 考馬斯亮藍(lán) R250+420ml 甲醇+100ml 冰乙酸，定容至 1000ml，混合 1h 后用 Whatman 1 號(hào)濾紙過(guò)濾，于室溫可無(wú)限期保存；

2. 脫色液配方：冰醋酸:甲醇:水＝7:5:88（V:V:V）；

3. 保存液：7％冰醋酸；

4. 凝膠染色之后，染色液可以回收利用，裝入新容器內(nèi)，室溫或 4 ?C 保存，可反復(fù)使用 2-4 次。

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP2/9）明膠酶譜法試劑盒

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