基質(zhì)金屬蛋白酶3(MMP-3)酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒使用說明書

本試劑僅供研究使用 目的：本試劑盒用于測定發(fā)酵豆粕樣本中基質(zhì)金屬蛋白酶3(MMP-3)活性。

實驗原理：

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標本中基質(zhì)金屬蛋白酶3(MMP-3)水平。用純化的基質(zhì)金屬蛋白酶3(MMP-3)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入基質(zhì)金屬蛋白酶3(MMP-3)，再與HRP 標記的基質(zhì)金屬蛋白酶3(MMP-3)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB 顯色。TMB 在HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的基質(zhì)金屬蛋白酶3(MMP-3)呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD 值），通過標準曲線計算樣品中基質(zhì)金屬蛋白酶3(MMP-3)活性濃度。

試劑盒組成：

試劑盒組成 48 孔配置 96 孔配置 保存

說明書 1 份 1 份

封板膜 2 片（48） 2 片（96）

密封袋 1 個 1 個

酶標包被板 1×48 1×96 2-8℃保存

標準品：180IU/L 0.5ml×1 瓶 0.5ml×1 瓶 2-8℃保存

標準品稀釋液 1.5ml×1 瓶 1.5ml×1 瓶 2-8℃保存

酶標試劑 3 ml×1 瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃保存

樣品稀釋液 3 ml×1 瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃保存

顯色劑A 液 3 ml×1 瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃保存

顯色劑B 液 3 ml×1 瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃保存

終止液 3ml×1 瓶 6ml×1 瓶 2-8℃保存

濃縮洗滌液 （20ml×20 倍）×1 瓶 （20ml×30 倍）×1 瓶 2-8℃保存

標本要求：

1．標本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融

2．不能檢測含NaN3 的樣品，因NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

操作步驟：

1. 標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設(shè)標準品孔10 孔，在*、第二孔中分別加標準品100μl，然后在*、第二孔中加標準品稀釋液50μl，混勻；然后從*孔、第二孔中各取100μl 分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl 棄掉，再各取50μl 分別加到第五、第六孔

中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各2取50μl 分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第七、第八孔中分別取50μl 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取50μl 棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50μl，

濃度分別為120 IU/L，80 IU/L，40 IU/L，20IU/L ，10IU/L）。

2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5 倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 分鐘。

4. 配液：將30（48T 的20 倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T 的20 倍）倍稀釋后備用。

5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 秒后棄去，如此重復(fù)5 次，拍干。

6. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。

7. 溫育：操作同3。

8. 洗滌：操作同5。

9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色

15 分鐘.

10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。

11. 測定：以空白空調(diào)零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。 測定應(yīng)在加終止液后15 分鐘以內(nèi)進行。

注意事項：

1． 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30 分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。

2． 濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。

3． 各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5 分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，使用排槍加樣。

4． 請每次測定的同時做標準曲線，做復(fù)孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD 值大于標準品孔*孔的OD 值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定，計算時請zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。

5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6． 底物請避光保存。

7． 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.

8． 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。

9． 本試劑不同批號組分不得混用。

10. 如與英文說明書有異，以英文說明書為準。

計算：

以標準物的濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標，

3

在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD

值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋

倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD 值計算出標

準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD 值

代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋

倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

（此圖僅供參考）

試劑盒性能：

1.樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R 值為0.95 以上。

2.批內(nèi)與批見應(yīng)分別小于9%和11%

檢測范圍：

5 IU/L -150 IU/L

保存條件及有效期：

1.試劑盒保存：；2-8℃。

2．有效期：6 個月