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免疫染色實驗方法和步驟編輯

1.樣品準(zhǔn)備(Sample preparation)

對于貼壁細胞：

Ø 可以直接用多孔板，例如6孔板、24孔板等，培養(yǎng)細胞，然后到預(yù)定時間時進行固定等后續(xù)操作。 Ø 也可以用潔凈的蓋玻片，70%乙醇中浸泡后，用無菌的鑷子放置到6孔板內(nèi)，然后用無菌的生理鹽水、PBS或培養(yǎng)液洗去殘留的乙

醇。這時就可以種入細胞進行培養(yǎng)，待細胞貼在蓋玻片上生長良好后，即可進行固定等后續(xù)操作。

對于懸浮細胞：

Ø 把細胞先在固定液中固定，然后把細胞滴加在載玻片上，干燥后細胞會緊貼在載玻片上。然后就可以進行后續(xù)操作。如果細胞的 粘附能力不佳，可以在載玻片上用PDL等物質(zhì)進行處理，以增強載玻片的粘附能力。

對于冷凍切片：

Ø

切片放置在載玻片上后，可以直接進行固定等后續(xù)操作。

對于石蠟切片：

Ø 脫蠟：切片在二甲苯中脫蠟5分鐘，再換用新鮮的二甲苯脫蠟，共用二甲苯脫蠟3次。無水乙醇5分鐘，兩次。90%乙醇5分鐘，兩

次，70%乙醇5分鐘，一次。蒸餾水5分鐘，兩次。

Ø 抗原修復(fù)：根據(jù)不同的抗原和抗體，可以選擇把切片放置在如下抗原修復(fù)液中，10mM檸檬酸鈉，pH6.0，或1mM EDTA，pH8.0，

或10mM Tris, pH10.0，95℃加熱12分鐘，大約在30分鐘內(nèi)緩慢冷卻至室溫。

2.固定

Ø 可以使用適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ汗潭毎蚯衅绫淘铺焐镌噭┑拿庖呷旧潭ㄒ?。固定完畢后，可以用免疫染色洗滌液洗滌兩次，?次5分鐘。

3.封閉(Blocking)

Ø

加入免疫染色封閉液，封閉60分鐘。如果背景較高，可以4℃封閉過夜。

Ø

從封閉開始所有的步驟，一定要注意樣品的保濕，避免樣品的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。

Ø 在整個免疫染色過程中我們使用碧云天的側(cè)擺搖床，側(cè)向擺動速度比較緩慢，而且也容易讓溶液覆蓋樣品。如果樣品比較容 易脫落，也可以把所有的步驟放置在桌面上靜止進行，即封閉、抗體孵育、洗滌等步驟均不需搖動，但靜止操作時宜適當(dāng)延長作

用時間或次數(shù)。

4.一抗孵育(Primary antibody incubation)

Ø

參考一抗的說明書，按照適當(dāng)比例用免疫染色一抗稀釋液稀釋一抗。

Ø 用微型臺式真空泵吸盡封閉液，立即加入稀釋好的一抗，室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。如果一抗孵育一小時效

果不佳，可以4℃緩慢搖動孵育過夜。

Ø 回收一抗。加入免疫染色洗滌液， 在側(cè)擺搖床上緩慢搖動洗滌5分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，洗滌5分鐘。共洗滌3次。

如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長洗滌時間并增加洗滌次數(shù)。

5.二抗孵育(Secondary antibody inucubation)

Ø 參考二抗的說明書，按照適當(dāng)比例用免疫熒光染色二抗稀釋液稀釋熒光標(biāo)記的二抗，或者用免疫染色(非熒光)二抗稀釋液稀釋辣 根過氧化物酶(HRP)或生物素(Biotin)或堿性磷酸酯酶(AP)標(biāo)記的二抗。 Ø

用微型臺式真空泵吸盡洗滌液，立即加入稀釋好的二抗，室溫或4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。

Ø 回收二抗。加入免疫染色洗滌液， 在側(cè)擺搖床上緩慢搖動洗滌5分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，洗滌5分鐘。共洗滌3次。

如果結(jié)果背景較高，可以適當(dāng)延長洗滌時間并增加洗滌次數(shù)。

6.蛋白檢測(Detection of proteins)

Ø

對于免疫熒光染色，此時已經(jīng)可以直接到熒光顯微鏡下觀察。

Ø

對于非免疫熒光染色可以選用DAB等適當(dāng)?shù)娘@色底物，或AB檢測體系等進行后續(xù)檢測。

7.多重染色(Multiple staining)

Ø 如果進行的是免疫熒光染色，通常都可以進行多重染色。對于可以產(chǎn)生有色沉淀物的染色反應(yīng)，例如DAB染色，一般不適合再進

行多重染色。

Ø 多重?zé)晒馊旧?/STRONG> 可以使用紅色熒光、綠色熒光和藍色熒光進行三重?zé)晒馊旧?。例如用免疫熒光染色試劑?抗小鼠Cy3進行紅色熒光染色，隨后可 以用免疫熒光染色試劑盒-抗兔Cy2進行綠色熒光染色，在完成上述兩種染色后可以使用Hoechst染色試劑盒對細胞核進行染色，

染色后為藍色熒光。

Ø 用HE染色進行復(fù)染：

免疫熒光染色后可以用蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒進行HE染色。

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