信帆分享：實(shí)驗(yàn)達(dá)人做Western-blot成功的秘訣
更新時(shí)間：2017-02-09 點(diǎn)擊次數(shù)：1665次信帆分享：網(wǎng)友做Western-blot成功的秘訣。信帆生物代做WB實(shí)驗(yàn)，歡迎大家！
1. 提取，組織一定要切成小塊，可以用剪刀剪或刀切，剪碎后再提取，蛋白濃度能高出一倍來。
2. 研磨一定要在冰上進(jìn)行，一般間斷研磨30分鐘就足夠了。
3. 離心，一般30分鐘。
4. 電泳，網(wǎng)上有人說膠要提前一天灌好，放一夜再用（有人說放冰箱里，有人說室溫），結(jié)果發(fā)現(xiàn)室溫放置后第二天上樣孔處就干了，變形不好上樣；zui關(guān)鍵的是，我發(fā)現(xiàn)，當(dāng)天新灌的膠走出來的條帶清楚，而提前一天做的則走出來?xiàng)l帶模糊；所以建議大家還是當(dāng)天做膠比較好。我一般是到實(shí)驗(yàn)室后，把制冰機(jī)打開，大冰凍離心機(jī)打開，然后開始做膠，把分離膠灌好以后，開始提取蛋白，1小時(shí)左右開始離心了，再灌濃縮膠；這樣膠大約有一個(gè)小時(shí)的凝固時(shí)間，足夠了。 要注意的是，灌完分離膠加水的時(shí)候，要貼玻璃板的一個(gè)角加水，否則膠的局部會(huì)受到影響，影響電泳條帶筆直度。
5. 電泳緩沖液可以重復(fù)用； 做膠的試劑買分析純的一般試劑使用一點(diǎn)問題都沒有，不用買進(jìn)口的很貴的所謂試劑； 我的蛋白分子量分別是40 和170，我分離膠用10%，濃縮用4%，一點(diǎn)問題都沒有，都走的很好，分的很開。
6. 轉(zhuǎn)膜，我一般電濕轉(zhuǎn)，80 V 電壓轉(zhuǎn)2小時(shí)，即使分子量170 kDa 的蛋白也能轉(zhuǎn)得過去，不用過夜的轉(zhuǎn)法，節(jié)省時(shí)間；我的40 kDa 和170 kDa 蛋白一起轉(zhuǎn)，沒有問題。
7. 封閉，我用5%奶粉，的，室溫下?lián)u晃封閉1小時(shí)，太長(zhǎng)了沒必要，更不一定需要過一夜。
8. 一抗，我用的是Santa的一抗，1：400稀釋（10 ul/4 ml 牛奶），用雜交袋搖晃雜交1小時(shí)，沒必要過夜；用雜交袋很省抗體；抗體不重復(fù)用；但是我當(dāng)天重復(fù)用兩次，效果也還可以；雜交的時(shí)候要保持蛋白面超上。
9. 洗一抗，我是室溫下洗10 X 3次。
10. 二抗，我用1:2000，室溫雜交50分鐘，也是用雜交袋，6 ml 左右，我的膜比。
11. 再洗二抗，同前。
12. 顯色，我是把膜蛋白面朝上放在培養(yǎng)皿上，然后往上面滴顯色AB液，反應(yīng)2-3分鐘，然后不擦干直接放暗盒里，上面蓋層保鮮膜，用筆畫出膜的邊緣，以免暗室內(nèi)找不到膜的位置。
13. 洗片，我用培養(yǎng)皿裝顯影劑，節(jié)省啊，然后撈出后用水沖一下，再放進(jìn)定影液里。
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