檸檬酸合成酶（CS）測定試劑盒

（citroyl synthetase Kit）

一、技術背景：

檸檬酸合成酶，即 citroyl synthetase，又稱檸檬酸縮合酶，

在三羧酸循環(huán)（又稱檸檬酸循環(huán)）中有非常重要的作用，因

為它催化的反應是關鍵步驟。而三羧酸循環(huán)是需氧生物體內(nèi)

普遍存在的代謝途徑，是三大營養(yǎng)素糖類、脂類、氨基酸代

謝聯(lián)系的樞紐和最終代謝通路。

三羧酸循環(huán)（英語：Tricarboxylic acid cycle；TCA cycle），

或檸檬酸循環(huán)（Citric acid cycle）或克雷伯氏循環(huán)（Krebs

Cycle），是需氧生物體內(nèi)普遍存在的代謝途徑，因為在這個

循環(huán)中幾個主要的中間代謝物是含有三個羧基的檸檬酸，因

此得名；或者以發(fā)現(xiàn)者漢斯·阿道夫·克雷伯命名為克雷伯氏循

環(huán)，簡稱克氏循環(huán)（Krebs cycle）。三羧酸循環(huán)是三大營養(yǎng)素

（糖類、脂類、氨基酸）的最終代謝通路，又是糖類、脂類、

氨基酸代謝聯(lián)系的樞紐。

在三羧酸循環(huán)中，反應物葡萄糖或者脂肪酸會變成乙酰

輔酶 A。這種“活化醋酸"（一分子輔酶和一個乙酰基相連），

會在循環(huán)中分解生成最終產(chǎn)物二氧化碳并脫氫，質(zhì)子將傳遞

給輔酶煙-酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）和黃素腺嘌呤（FAD），

使之成為 NADH + H+和 FADH2。NADH + H+和 FADH2 會

繼續(xù)在呼吸鏈中被氧化成 NAD+和 FAD，并生成水。這種受

調(diào)節(jié)的“燃燒"會生成 ATP，提供能量。

真核生物的線粒體和原核生物的細胞質(zhì)是三羧酸循環(huán)的

場所。它是呼吸作用過程中的一步，但在需氧型生物中，它

先于呼吸鏈發(fā)生。厭氧型生物則首先遵循同樣的途徑分解高

能有機化合物，例如糖酵解，但之后并不進行三羧酸循環(huán)，

而是進行不需要氧氣參與的發(fā)酵過程。

在三酸酸循環(huán)第一步反應中，催化乙酰輔酶 A 的乙基與

草酰乙酸的酮基結合生成檸檬酰輔酶 A，以便后續(xù)高能硫酸

鍵水解，釋放出輔酶 A，得到檸檬酸。檸檬酸合成酶是一個

調(diào)控酶，此酶的底物乙酰輔酶 A 和草酰乙酸是它的激活劑，

NADH、琥珀酰輔酶 A 是抑制劑。

三、所需儀器：

酶標儀（412nm）、微量移液器、漩渦混勻器、高速離心

機、37℃水浴/氣浴箱、臺式離心機、研缽或高速組織分

散器（勻漿機）、冰、雙蒸水、離心管（1.5mL 或 2mL）。

四、試劑組成及配制：（A108-1-1 20T）

㈠、前處理試劑：

提取液 20mL×1 瓶，4℃保存。

沖洗液 50mL×1 瓶，4℃保存。

㈡、反應試劑：

試劑一：緩沖液 4mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：底物液 0.6mL×1 支，-20℃避光保存。

試劑三：顯色劑 0.6mL×1 支，-20℃避光保存。

試劑四：陰性對照液：0.2mL×1 支，4℃避光保存。

五、試劑組成及配制：（A108-1-2 50T）

㈠、前處理試劑：

提取液 50mL×1 瓶，4℃保存。

沖洗液 100mL×1 瓶，4℃保存。

㈡、反應試劑：

試劑一：緩沖液 10mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：底物液 1.4mL×1 支，-20℃避光保存。

試劑三：顯色劑 1.4mL×1 支，-20℃避光保存。

試劑四：陰性對照液：0.5mL×1 支，4℃避光保存。

六、試劑盒存放：

本．試．劑．盒．收．到．后．按．規(guī)．定．條．件．存．放．，．有．效．期．6．個．月．。．

七、友情提醒：

本試劑盒內(nèi)所有試劑僅限于科學研究使用，不得用于臨

床診斷及藥物治療等。

八、操作步驟：

1、樣本前處理：

A）方法一：液氮研磨

①、樣本準備：取出新鮮組織或冷凍組織（4℃解凍或室

溫解凍），用沖洗液沖洗干凈，濾紙吸干，準確稱取

組織重量 100～300mg,加入液氮，快速用研磨棒碾

碎組織成粉末狀，備用。

②、10%待測懸液制備：取研磨后組織粉末稱重置于離

心（1.5mL 或 2mL）管中，并按重量(g)：體積(mL)=1：

9 的比例加入 9 倍體積的提取液，渦旋混勻器劇烈

混勻 30 秒，間隔 2 分鐘，重復操作 2～3 次，制備

10%待測懸液。放回冰槽環(huán)境回溫。

③、離心處理：將裝有 10%待測懸液的離心管置于 4℃

臺式離心機，10000 轉(zhuǎn)/分鐘，離心 10 分鐘。

④、10%待測上清制備：取出離心管置于冰槽環(huán)境，小

心吸取 10%待測上清液轉(zhuǎn)移到新離心管（1.5mL 或

2mL）待測，同時用考馬斯亮藍試劑（或 BCA 試劑）

測定蛋白濃度（本所有售）。

B）方法二：機械勻漿（如不具備液氮操作條件）

①、10%待測懸液制備： 取出新鮮組織或冷凍組織（4℃

解凍或室溫解凍）,用沖洗液沖洗干凈,濾紙吸干；準

確稱取組織重量，按重量（g）：體積(mL)=1:9 的比

例，加入 9 倍體積的提取液，冰水浴條件下機械勻

漿，制備成 10%待測懸液。

②、離心制備 10%待測上清：10000 轉(zhuǎn)/分，離心 10 分鐘，

吸取上清即為 10%的待測上清液。同時用考馬斯亮

藍試劑（或 BCA 試劑）測定組織蛋白濃度。

2、操作步驟：

⑴、儀器準備：

將酶標儀設定到待測波長（412nm），預溫 30min，

使之各項指標參數(shù)處于較穩(wěn)定使用狀態(tài)。

⑵、試劑準備：

將冷凍試劑（底物液、顯色劑）與冷藏試劑（緩沖

液、陰性對照液）取出，平衡至室溫后使用。

⑶、樣本準備：

將待測樣本置于冰槽回溫平衡后待測。

⑷、反應步驟（96 孔板操作）：（附贈 96 孔板 1 塊）

a、取干凈無菌 96 孔酶標板，置于試驗臺水平放置

并標記待測樣本編號，即 U 孔（或陰性對照孔，

即 O 孔）；

b、加入試劑一（緩沖液）190μL 于 96 孔酶標板 U

孔（或 O 孔）中；

c、加入試劑二（底物液）25μL 于上述 U 孔（或 O

孔）中；

d、加入試劑三（顯色劑）25μL 于上述 U 孔（或 O

孔）中；

e、將加入上述試劑 96 孔酶標板輕搖混勻并置于

37℃孵育箱 3～5min；

f、取出裝有預溫試劑的 96 孔酶標板，水平置于試

驗臺；

g、加入待測樣本 10μL 于上述 U 孔中（或陰性對

照液 10μL 于 O 孔中）（待．測．樣．本．須．澄．清．，．凍．存．

后．復．溶．樣．本．據(jù)．情．況．需．離．心．除．去．析．出．蛋．白．后．再．

用．）；

h、輕搖該酶標板，使待測樣本（或陰性對照液）

與預溫試劑充分接觸；并將該操作 96 孔酶標板

轉(zhuǎn)入酶標儀，波長 412nm，測定待測樣本吸光

度 OD 值，記為 AU0（陰性對照孔為 AO0）；

i、將該 96 孔酶標板轉(zhuǎn)入 37℃孵育箱（或者在 37℃

恒溫酶標儀）中溫浴 15min；

j、再將該操作 96 孔酶標板轉(zhuǎn)入酶標儀，波長

412nm，測定待測樣本吸光度 OD 值，記為 AU15

（陰性對照孔為 AO15）；；

k、待測樣本值（U 孔）：待測樣本吸光度 AU15— 待

測樣本吸光度 AU0。

【陰性對照值（O 孔）：AO15-AO0】

檸檬酸合成酶（CS）測定試劑盒