信帆生物:無需參考的甲基化分析新方法[創(chuàng)新技巧]
更新時間:2016-04-13 點擊次數(shù):1458次生物通報道 分析DNA甲基化的高通量方法大多依賴參考基因組,而許多物種不一定有。zui近,奧地利的研究人員就開發(fā)出一種方法,在沒有參考基因組的情況下分析DNA甲基化。這項成果于本周發(fā)表在《Cell Reports》上。
文章的*作者是奧地利科學(xué)院CeMM分子醫(yī)學(xué)研究中心的Johanna Klughammer。她及其同事將簡化甲基化測序(reduced representation bisulfite sequencing,RRBS)與一種名為RefFreeDMA的應(yīng)用程序相結(jié)合。這種程序能從RRBS讀取中推斷出基因組,并發(fā)現(xiàn)樣品中差異甲基化的區(qū)域。
她們開發(fā)的這個流程依賴于脊椎動物中DNA甲基化的非隨機分布,大多數(shù)甲基化都位于CpG位點。在她們這個方法中,DNA先通過限制性內(nèi)切酶Mspl和/或Taql消化,這兩種酶分別切割C^CGG和T^CGA,并且對甲基化不敏感。之后,這些消化后的序列被用來創(chuàng)建RRBS測序文庫。
研究人員指出,他們利用九個物種(人、小鼠、大鼠、牛、狗、雞、鯉魚、鱸魚和斑馬魚),驗證和優(yōu)化了96孔RRBS方法的基因組覆蓋度和樣品通量,將所覆蓋的CpG位點數(shù)量從250萬個提高到400萬個。
RefFreeDMA是一個基于Linux的軟件流水線,利用了RRBS讀取的特點,如明確的起始和中止點。通過匯集特定物種中所有樣品的RRBS讀取,這個應(yīng)用程序推斷出每個集群的一致序列。在胞嘧啶和胸腺嘧啶同時存在的情況下,研究人員指出,胞嘧啶被保留,因為這可能反映了甲基化的胞嘧啶。
一旦生成了推導(dǎo)的基因組,研究人員便利用BSMAP/RRBSMPA將讀取與一種自定義的DNA甲基化檢出腳本相比對,以評估每個CpG位點的甲基化部分。隨后,研究人員將差異甲基化的讀取進行排序。那些排名靠前的讀取被導(dǎo)出為FASTA/FASTQ文件,通過已注釋的相關(guān)基因組來進行生物學(xué)解釋。
為了驗證這種方法,Klughammer及其同事將其應(yīng)用在三個物種(人、牛和鯉魚)的44個樣品中,并比較了無參考和有參考的分析。他們發(fā)現(xiàn),對于兩種方法,CpG位點的平均DNA甲基化水平在很大程度上是相似的。同時,推導(dǎo)的基因組也大體反映了參考基因組。例如,1,522,786個推導(dǎo)基因組片段中的1,254,324個可比對到人類基因組。
“我們對代表性染色體的比對位置進行作圖時,發(fā)現(xiàn)這兩種方法有著很好的一致性,而對于所有樣品和所有物種,這兩種方法所獲得的DNA甲基化值也高度一致,”Klughammer及其同事在文中寫道。
研究人員指出,這種方法不僅能夠應(yīng)用于野生種群,也能夠應(yīng)用于農(nóng)業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖的樣品。
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